蛤弧菌探針法定量PCR熒光檢測試劑盒

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

儲存條件：

14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

探針法：
蛤弧菌探針法熒光定量PCR檢測試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。它與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系。相對于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準確性。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備O157:H7標準曲線（以10-10E6這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2和1號。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標準品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對照。
5. 換槍頭，從6號管中取5 μL溶液到5號管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對照。
6. 換槍頭，從5號管中取5 μL溶液到4號管中，重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。
7. NC管中不加任何陽性對照。
8. 從1-6號管中分別取5 μL和待測樣品一起進行定量PCR（見下步），每個樣品做3次重復。PCR后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對數值為橫軸，繪制標準曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DN段作為陽性對照。
2.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用
8.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。設置 qPCR 反應（20  μL 體系，在樣品制備室進行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產品：

NIPP1/ARD1  核抑制蛋白酸酶1抗體三糖鐵(TSI)瓊脂

NIPAL3  NIPA樣蛋白3抗體培養基

NIPAL2  NIPAL2蛋白抗體三糖鐵(TSI)瓊脂斜面

NIPA  間變性淋巴瘤激酶核相互作用伴侶蛋白抗體賴氨酸脫羧酶試驗培養基

Ninjurin 2  神經損傷誘導蛋白2抗體賴氨酸脫羧酶試驗

Ninjurin 1  神經損傷誘導蛋白1抗體氨基酸脫羧酶試驗對照

Ninein/GSK3B interacting protein  GSK3B相互作用蛋白抗體無菌液體石蠟

NIMP/RTN4IP1  NOGO相互作用線粒體蛋白1抗體ONPG 培養基

NIK/MAPKKK14  NFkB誘導激酶抗體營養瓊脂（NA）

NIFK  KI67相互作用蛋白抗體營養瓊脂平板（NA）

Nidogen 2  巢蛋白NID2抗體蛋白胨水（胰蛋白胨培養基）

Nicastrin  老年性癡呆蛋白APH2抗體培養基

NHLRC3  非霍奇金淋巴瘤重復蛋白3抗體Kovacs 靛基質試

NHLRC2  非霍奇金淋巴瘤重復蛋白2抗體緩沖葡萄糖蛋白胨水

NHLRC1  肌痙攣性癲癇病相關EPM2蛋白抗體V-P 試豬繁殖與呼吸綜合征病通用型RT-PCR檢測試盒白皮杉醇

蛤弧菌探針法熒光定量PCR檢測試劑盒豬繁殖與呼吸綜合征病（Nsp2 1594~1680變異株）RT-PCR檢測試盒白屈菜紅

豬繁殖與呼吸綜合征病通用型實時熒光RT-PCR檢測試盒白屈菜

豬繁殖與呼吸綜合征病（Nsp2 1594~1680變異株）實時熒光RT-PCR檢測試盒白術內酯Ⅰ

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）實時熒光RT-PCR檢測試盒白術內酯Ⅱ

豬繁殖與呼吸綜合征病美洲株實時熒光RT-PCR檢測試盒白術內酯III

豬繁殖與呼吸綜合征病歐洲株實時熒光RT-PCR檢測試盒白頭翁素

豬繁殖與呼吸綜合征病美洲型經典株與高致病性變異株雙重實時熒光RT-PCR檢測試盒白頭翁皂苷A

豬繁殖與呼吸綜合征病歐洲株與美洲株雙重實時熒光RT-PCR檢測試盒白頭翁皂苷B

豬繁殖與呼吸綜合征（類NADC-30株） 實時熒光RT-PCR檢測試盒白頭翁皂苷B4