牛細(xì)小病毒探針法熒光定量PCR檢測試劑盒

注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

儲存條件：

14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

探針法：
牛細(xì)小病毒探針法熒光定量PCR檢測試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團(tuán)連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。相對于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線（以10-10E6這6個10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2和1號。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對照。
5. 換槍頭，從6號管中取5 μL溶液到5號管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對照。
6. 換槍頭，從5號管中取5 μL溶液到4號管中，重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。
7. NC管中不加任何陽性對照。
8. 從1-6號管中分別取5 μL和待測樣品一起進(jìn)行定量PCR（見下步），每個樣品做3次重復(fù)。PCR后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應(yīng)用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DN段作為陽性對照。
2.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用
8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20  μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產(chǎn)品：

瑞美松龍標(biāo)準(zhǔn)品豚鼠基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)ELISA Kit，48T/96T

利塞膦酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)ELISA Kit，48T/96T

利塞膦酸相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)ELISA Kit，48T/96T

利塞膦酸相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品豬基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)ELISA Kit，48T/96T

利塞膦酸相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)ELISA Kit，48T/96T

利培酮標(biāo)準(zhǔn)品兔子基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)ELISA Kit，48T/96T

牛細(xì)小病毒探針法熒光定量PCR檢測試劑盒利培酮系統(tǒng)適用性用混合物標(biāo)準(zhǔn)品豚鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)ELISA Kit，48T/96T

利培酮雜質(zhì)混合物標(biāo)準(zhǔn)品人基質(zhì)金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9/Gelatinase B)

鹽酸利托君標(biāo)準(zhǔn)品倉鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9) ELISA Kit，48T/96T

利托那韋標(biāo)準(zhǔn)品小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9)ELISA Kit，48T/96T

利托那韋相關(guān)物質(zhì)混合物標(biāo)準(zhǔn)品豬基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)ELISA Kit，48T/96T

卡巴拉汀酒石酸鹽K-異構(gòu)體大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9) ELISA Kit，48T/96T

酒石酸卡巴拉汀標(biāo)準(zhǔn)品兔子基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)ELISA Kit，48T/96T

利托那韋相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品人基質(zhì)金屬蛋白酶4(MMP-4)ELISA Kit，48T/96T

利托那韋相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶4(MMP-4)ELISA Kit，48T/96T CETP  膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抗體野百合堿

CESK1  分子伴侶CESK1蛋白抗體葒草苷

Ceruloplasmin  銅藍(lán)蛋白抗體異葒草苷

CERKL  視網(wǎng)膜色素變性蛋白26抗體紫云英苷

CERK  神經(jīng)酰胺激酶CERK抗體對葉百部堿

CEP97  中心體蛋白97kDa抗體仙茅苷

CEP76  中心體蛋白質(zhì)76抗體(R型)人參皂苷Rh2

CEP55  中心體蛋白55kDa抗體白花前胡素

CEP152  中心體蛋白152抗體白花前胡素

CEP128  中心體蛋白128抗體貝母辛

Centaurin γ1  中心體肌動蛋白γ1抗體（增強(qiáng)型PI3K蛋白）地奧司明

CENPT  著絲粒蛋白T抗體香蒲新苷

CENPP  著絲粒蛋白P抗體哈巴俄苷

CENPO  著絲粒蛋白O抗體哈巴苷

CENPH  著絲粒蛋白H抗體安格洛甙C